LES MICROSCOPES OPTIQUES: PLONGEON DANS LE MONDE DE L'INFINIMENT PETIT

« fonctionnement du microscope d'une lampe .

Dans l'éclairage que l'on emploie le plus souvent, et que l'on appelle éclairage Ktihler , le condenseur est positionné de sorte que chaque point du filament éclaire la totalité de l'objet de manière uniforme .

Chaque point de l'objet est ainsi éclairé par tous les points du filament.

Deux diaphragmes, le premier avant le condenseur, le second après le condenseur, permettent d'optimiser cela.

Par ailleurs, il existe des condenseur à immersion : sur le condenseur on dépose une goutte d'huile que la lame de la préparation vient écraser.

SYsrtMES COMPLEXES DE LENTILlES !:image que fournit une lentille présente toujour s des défauts que l'on désigne par aberrations.

Ces défauts se manifestent par des déformations de l'image (aberrations géométriques) et des irisations colorées (aberrations chromatiques).

On les élimine ou les réduit en employant un grand nombre de lentilles parfoi s accolées, ce qui améliore nettement la qualité de 1 --=----=~!!!!!!!!!!!~=:::.._...,.------------ ~ l'image, mais augmente le prix du 1- microscope.

grossissement de 2500.

Cependant une telle combinaison est totalement inefficace, car l'image sera grande mais floue .

PouvoiR stPARATEUR Ce qui compte davantage dans un microscope est sa limite de séparation que l'on appelle aussi minimum séparable.

C'est la distance minimale séparant deux points (de l'objet) dont on obtient deux images bien nettes sans qu'elles ne se chevauchent.

En effet, en raison de la nature ondulatoire de la lumière, on n'obtient pas un point image de chaque point de l'objet mais une petite tache dont le diamètre est de l'ordre de la longueur d'onde de la lumière employée :c'est la diffraction.

Aussi, lorsque la distance entre deux points est inférieure à cette longueur d'onde, les deux taches obtenues se recouvrent.

De ce lai~ dans la pratique, un grossissement supér ieur à 1 400 est sans intérêt dans un microscope optique, car au-delà, les détails dans l'image deviennent flous, bien que l 'image elle-même soit plus grande.

!:inverse du minimum séparable est appelée pouvoir séparateur.

Dans le meilleur des cas, on est limité par la longueur d'onde de la lumière (visi ble), de l'ordre de 0,5 micromètre, si bien qu'on ne peut pas révéler des détails inférieurs à cette dimension à l'aide d'un microscope photonique.

Cela correspond à un pouvoir séparateur environ 200 fois meilleur que celui de l'œil .

A signaler aussi qu'on emploie parfois le terme résolution ou pouvoir de résolution ; cependant, certains l'emp loient comme synonyme de limite de séparation, d'autres comme synonyme de pouvoir séparateur.

Il faut donc y faire attention.

le microscope décrit plus haut présente cet instrument dans sa forme la plus simple et la moins performante.

Mais, quelques techniques et dispositifs permettent d 'en améliorer les performances.

Il s'agit principalement de la technique de l'immersion et l'emploi du condenseur, mais aussi des systèmes complexes de lentilles .

IMMERSION Comme indiqué plus haut, la limite de séparation d'un microscope dépend de la longueur d'onde de la lumière employée.

Plus précisément , elle lui est proportionnelle.

Or, il existe un moyen simple de réduire u artificiellement » cette longueur d'onde .

Il suffit de faire en sorte qu'au moment où la lumière pénètre dans l'objectif , après avoir traversé l'échantillon , elle ne soit pas dans l'air mais dans un milieu transparent d 'indice n élevé.

En elfe~ la vitesse de propagation dans un tel milieu étant n fois plus faible , la longueur d'onde y devient n fois plus courte.

En pratique, la technique de l'immersion consiste à déposer une goutte d'huile sur la lamelle qui couvre l'échantillon et d'abaisser l'objectif jusqu'à son immersion dans l'huile.

Si l'indice de cette dernière vaut 2, le minimum séparable sera deux fois plus faible que sans immersion.

On obtient ainsi dans les meilleurs microscopes à immersion une limite de séparation de 0,2 micromètre , soit un pouvoir séparateur 500 fois supérieur à celui de l'œil.

CONDENSEUR n DIAPHRAGME Généralement , la source de lumière qui éclaire l 'objet est située sous ce dernier.

Or, la qualité de l'image dépend fortement de la manière dont l'échantillon est éclairé .

Afin d'avoir un bon éclairemen~ on emploie ce que l'on appelle un condenseur .

Il s'agit d'un système complexe de lentilles muni d'un ou deux diaphragmes situ ès entre la source de lumière et l 'échantillon.

le plus souvent le condenseur est monté sur une glissière, ce qui permet d 'ajuster sa hauteur pour régler sa position entre la source et l'échantillon .

Son rôle consiste à faire en sorte que l'objet soit éclairé de manière uniforme, bien que la source de lumière elle-même ne soit pas uniforme puisqu'il s'agit du filament LES DIFFÉRENTS TYPES DE MICROSCOPES OPTIQUES Il existe une très grande variété de microscopes optiques.

Nous allons en mentionner les principaux types.

MICROSCOPE À FOND NOIR Dans un microscope classique, lorsqu'on regarde dans l'ocu laire , on voit l'objet sur un fond clair.

Au contraire, dans le microscope à fond noir , comme son nom l'indique, le fond est noir .

Dans ce genre de microscope, après avoir travers é l'obje~ la lumière en provenance du condenseur ne pénètre pas directement dans l'objectif .

De ce lai~ si le fond de la préparation ne diffuse pas la lumière , il apparaîtra noir.

En revanche toute zone de l'objet capable de diffuser la lumière apparaît claire (sur un fond sombre).

C'est le cas de tous les contours notamm ent.

De même.

tout changement d'indice de réfraction de l'objet provoque la diffusion de la lumière , si bien que toutes les frontières séparant deux régions d'indices différents apparaissent en clair .

Il faut savoi r que dans un microscope à fond clair, ces frontières sont à peine visibles ...

Il est facile de transformer un microscope à fond clair en un microscope à fond noir : il suffit de changer de condenseur , ce qui est une opération simple .

LE srtRtOMICROSCOPE Dans un stéréomicroscope , il existe deux tubes optiques .

!:échantillon est éclairé par le bas ou par le haut selon que l'on effectue une observation par transmission ou réflexion, cela LL.tl ..

llllll dépendant de la nature de l 'échantillon, transparent ou non.

le stéréomicroscope le plus simple est en fait la loupe binoculaire, où la vision de l'échantillon sous deux angles légèrement différents donne une sensation de relief .

MICROSCOPE POLAIIISANT Un microscope polarisant est tout simplement un microscope photonique ordinaire dans lequel l 'objet est placé entre deux polariseurs croisés.

En absence de l'obje~ les deux polariseurs étant croisès, aucune lumière ne peut être observée à travers l'oculaire, car elle ne peut franchir le second polariseur .

Or, certains corps transparents sont capables de faire tourner la direction de polarisation de la lumière, c'est­ à-dire l'axe dans lequel vibrent les ondes lumineuses.

Aussi, en plaçant l'objet à examiner entre les deux polariseurs , on révèle certaines structures de l'objet , invisibles sans polariseur .

Or, dans certaines cellules, de telles structures existent justement.

Souvent leurs dimensions sont inférieures à la limite de séparation.

Cependan~ le microscope polarisant permet parfois de les révéler .

MICROSCOPE À FLUORESCENCE En microscopie à fluorescence, on observe des objets fluorescents.

Ces derniers sont naturellement fluorescents ou rendus artificiellement fluorescents .

Dans tous les cas, il est nécessaire de provoquer la fluorescence de l'objet ce qui implique d'équiper le microscope d'un dispositif qui éclaire l'objet en ultraviolet, et de filtres pour observer la lumière de fluorescence émise .

les principales applications de la microscopie par fluorescence se font en biologie, notamment en immunologie: c'est l'immunofluorescence .

Cette technique permet de localiser une protéine grâce à un anticorps fluorescent qui se lie à elle.

MICROSCOPE À CONTRAm DE PHASE Dans un microscope ordinaire, les différentes structures de l 'objet examiné -par exemple une cellule- sont révélées parce qu'elles absorbent la lumière de manière inégale, si bien que certaines parties apparaissent plus sombres que d'autres .

.

Si toutefois l'échantillon est trop transparen~ on emploie des pigments qui colorent différemment les différentes parties de la cellule.

Mais cette opération entraîne la mort de celle-ci .

Si on ne souhaite pas tuer la cellule, on est obligé d'employer une autre technique, celle de la microscopie à contraste de phase .

Son principe de fonctionnement s 'appuie sur la nature ondulatoire de la lumière .

En elfe~ les différentes parties transparentes de l'échantillon ne possédant pas le même indice de réfraction, la lumière ne s'y propage pas à la même vitesse .

De ce tai~ un déphasage apparaît entre les ondes.

A la sortie de l'échant illon, les ondes n 'étant plus en phase , les interférences entre ces ondes provoquent l'apparition de zones plus ou moins claires, des contrastes, d'où le nom de ce genre de microscope .

MICROSCOPE INTERFtiENTIEL le microsco pe interférentiel est sans doute le microscope le plus complexe .

Aussi, sans détailler, nous ne donnerons que le principe de base sur lequel repose le fonct ionnement de ce microsco pe.

On fait en sorte que deux faisceaux parallèles , en phase et très proches l'un de l'autre (à une distance légèrement inférieure à la limite de séparation du microscope) traversent chaque partie de l'objet.

Si les deux faisceaux traversant une zone rencontrent exactement les mêmes obstacles et propriétés optiques, ils seront toujours en phase à la sortie de l'objet et produiront des interférences constructives.

Mais la moindre différence entre les deux trajets, qu'il s'agisse d'une différence d 'épaisseur ou d'indice, provoquera un déphasage entre les deux faisceaux et conduira à une image plus ou moins contrastée, ce qui révél era la présence d'irrégularités .

MICROSCOPE À BALAYAGE LASER CONFOCAL Ici, la lumière employée pour éclai rer l'échantill on est une lumière laser qui descend le long du tube du microscope et traverse l'objectif avant de tomber sur la préparation.

On observe la lumière renvoyée par celle-ci.

En lai~ le faisceau laser balaye l'échantillon point par poin~ ce qui explique la dénomination u microscope à bo/oyog e /oser ».

le s points balayés par le faisceau sont tous situés dans le même plan de coupe dans l'épaisseur de l'échantillon.

On obtient cela en focalisant le faisceau toujours dans le même plan , d'où le terme u confocal ».

Ainsi , toute la lumière renvoyée provient d'un même plan, celui qui a été balayé .

!:absence de lumière parasite provenant d'autres plans donne une netteté tout à fait exceptionnelle à l'image.

Par ailleurs, en balayant divers plans de coupe , les uns après les autres , on réalise une tomographie optique de la préparation.

les techniques de traitement d 'image permettent ensuite de révéler la structure tridimensionnelle de l'échantillon .

MICROSCOPE À CHAMP PROCHE OPTIQUE Comme dans un microscope optique ordinaire, on éclaire l'échantillon, mais on observe une composante d e la lumière renvoyée par celui-ci qui se trouve à une distance inférieure à la longueur d'onde de la lumière : c'est ce que l'on appelle la composante évanescente de l'onde .

Dans ces conditions , il n'y a plus diffraction et la limite de s éparation est de l'ordre de 100 fois inférieure à la longueur d'onde employée.

Ainsi, une lumière jaune de 0,5 micromètre permet de révéler des détails de 5 nanomètres.. »