PRINCIPALES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET EXEMPLES D'APPLICATION AU DIAGNOSTIC.

PRINCIPALES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET EXEMPLES D'APPLICATION AU DIAGNOSTIC. I. TECHNIQUES DE BASE. A. Extraction des acides nucléiques. 1/ Extraction de l'ADN. Technique classique. Les Kits. Il existe maintenant des kits qui permettent un gain de temps (Biosciences, Amersham...) À partir de 5 ml de sang: - Hémolyse des globules rouges - Récupérations des globules blancs en centrifugeant - Elimination des protéines avec une résine qui contient des fonctions aldhéides qui forment un complexe avec les groupements NH2 des protéines - Elimination de la résine et récupération de l'ADN dans la phase aqueuse - Précipitation à l'Ethanol. -Qualité de l'échantillon d'ADN: Il faut que le rapport DO260/DO280 soit compris entre 1,8 et 2. Si il est inferieur à 1,8, il reste trop de protéines. Si il est suprieur à 2 l'ADN est dégradé. Une dégradation de l'ADN peut être observée apres éléctrophorèse sur gel d'agarose en présence de BET. Les petits fragments issus de la dégradation migrent loin. -Quantification de l'ADN: 1 unité DO260nm correspond à une concentration d'ADN de 50µg/ml. 1/9 www.mediprepa.com 2/ Extraction de l'ARN. Purification: Les ARN sont très instables, des molécules stabilisantes comme la RNAsine sont ajoutées. Le principe de la purification est le même que pour l'ADN (extraction, précipitation). Quantification: 1 unité DO260 correspond une concentration de à 30µg/ml. Qualité de l'échantillon: Sur éléctrophorèse en gel d'agarose et BET, on visualise l'état de dégradation des ARN majoritaires (ARNr). B. Les enzymes de restriction. Ce sont des enzymes d'origine bactérienne capable de se lier à des sequences spécifiques d'ADN double brin et de couper celui-ci à un site situé dans ou à proximité de la séquence reconue. On les appelle endonucléases de restriction. 1/ Nomenclature. 1ere lettre en majuscule : origine bactérienne de l'enzyme. 2 lettres suivantes : genre de la bactérie. 1 lettre suplémentaire : souche bactérienne si nécessaire. Chiffre romain : numéro selon l'ordre de la découverte de l'enzyme dans la même souche bactérienne. EcoRI coli Escherichia 1ere enzyme découverte chez cette bactérie. Plasmide 2/ Spécificité et coupure. Les enzymes utilisées en biologie moléculaire sont de type II. Elles reconnaissent des séquences palindromiques de 4 à 6 paires de base. La coupure s'effectue au même endroit de la séquence sur les deux brins. Site de reconnaissance de EcoRI 5' 3' GAATTC CTTAAG...