PRINCIPALES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET EXEMPLES D’APPLICATION AU DIAGNOSTIC.

C. Le Southern blot.

Principe d’analyse de l’ADN qui consiste à détecter une séquence spécifique.

1/ Principe.

- Purification de l’ADN.

- Hydrolyse de l’ADN avec une enzyme de restriction.

- Séparation des fragments générés par éléctrophorèse en gel d’agarose.

- Dénaturation ADN double brin -> ADN simple brin.

- Transfert sur support solide (membrane) par capilarité.

- Hybridation avec une sonde spécifique de la séquence à détecter marquée au 32P.

Il y a formation d’un duplex stable qui résiste aux lavages efféctués pour éliminer les excès

de sonde.

- Révélation par autoradiographie.

2/ Applications.

Mise en évidence de réarrangements chromosomiques.

Diagnostics de maladies héréditaires:

- délétions ou insertions de grandes tailles

- Mutations au niveau d’un site de restriction.

3/ Inconvénients.

Nécessité de disposer d’une grande quantité d’ADN très pur, long et coûteux.

D. Analyse de l’expression d’un gène.

1/ Le Northern blot.

Les ARN purifiés sont séparés par électrophorèse, puis une sonde spécifique détecte les

ARN issus de l’expression du gène étudié.

L’expression d’un gène domestique (exprimé de la même façon quel que soit le type

cellulaire) est aussi détectée afin de s’assurer que la quantité d’ARN utilisée pour chaque

échantillon est la même.